دسته: برق ، الکترونیک و مخابرات در مهندسی بافت، سلول ها بر روی یك بستر از جنس پلیمر زیست تخریب پذیر بسیار متخلخل استقرار یافته، رشد و تكثیر می یابند روند رشد این سلول ها در جهت بازسازی بافت در سه بعد است یكی از اساسی ترین قسمت های مهندسی بافت، داربست های زیست تخریب پذیر هستند كه تحت نام Scaffold شناخته می شوند
قیمت فایل فقط 8,900 تومان
ساخت داربست های مهندسی بافت به روش Gas Foaming
| عنوان | صفحه |
| × پیشگفتار | 1 |
| × نتایج قانونمند و استاندارد شده | 5 |
| × گزینش و جداسازی سلول | 35 |
| × تولید داربستهای پلیمری: قالب گیری حلال | 72 |
| × تولید داربستهای پلیمری: لایه سازی غشاء | 84 |
| × تولید داربستهای پلیمری: انجماد - خشك سازی | 106 |
| × تولید داربستهای پلیمری: اشكال كامپوزیت پلیمر- سرامیك | 121 |
| × تولید داربستهای پلیمری: جداسازی فاز | 142 |
| × تولید داربستهای پلیمری: پلیمریزاسیون (بسپارش) | 162 |
| × تولید داربستهای پلیمری: پردازش اسفنج گازی | 176 |
| × بر هم كنشهای سلولی سطح مصنوعی: بیومواد خود مجتمع | 192 |
| × بر هم كنشهای سلولی سطح مصنوعی: چسبندگی سلول هدف | 216 |
پیش گفتار
یكی از معضلات بزرگی كه علم پزشكی از دیرباز با آن درگیر بوده است، ارائه درمانی قطعی برای بازسازی بافت های از كار افتاده و یا معیوب است. متداول ترین شیوه در درمان این نوع بافت ها، روش سنتی پیوند است كه خود مشكلات عدیده ای را به دنبال دارد. از جمله این مشكلات می توان به كمبود عضو اهدائی، هزینه بالا و اثرات جانبی حاصل از پیوند بافت بیگانه Allograft)) كه مهمترین آنها همان پس زنی بافت توسط بدن پذیرنده است اشاره كرد. این محدودیت ها دانشمندان را بر آن داشت تا راه حلی مناسب برای این معضل بیابند.
مهندسی بافت با عمر حدوده 1 ساله خود روشی نوید بخش در تولید گزینه های بیولوژیكی برای كاشتنی ها (Implants) و پروتزها ارائه كرده و وعده بزرگ تهیه اندام های كاملاً عملیاتی برای رفع مشكل كمبود عضو اهدائی را می دهد. اهداف مهندسی بافت فراهم سازی اندام های كارآمد یا جایگزین های قسمتی از بافت برای بیمارانی با ضعف یا از كارافتادگی اندام و یا بیماری های حاد است كه این امر با استفاده از روش‌های درمانی متنوع اندام مصنوعی- زیستی تحقق می یابد. بنا به تعریف، مهندسی بافت رشته ای است كه از تركیب علم بیولوژی مواد و علم مهندسی یا به عبارتی Biotech جهت بیان ارتباطات ساختاری بافت های فیزیولوژیكی و طبیعی پستانداران در راستای توسعه روش های نوین ترمیم بافت و جایگزین سازی بافت، توسعه یافته است. مهندسی بافت شامل مباحثی نظیر تركیبات نوین سلول ها، بیومواد غیرسلولی، داروها، فرآورده های ژنی یا ژن هایی می باشد كه قابل طراحی، تشخیص و ساخت بوده و امكان رهایش آنها به طور همزمان یا ترتیبی به عنوان عامل های درمانی میسر باشد. اگرچه داروها یا بیومواد غیر سلولی به مواد بسیاری اطلاق می گردد اما درمان های منهدسی بافت در واقع منحصر به فرد هستند.
در مهندسی بافت، سلول ها بر روی یك بستر از جنس پلیمر زیست تخریب پذیر بسیار متخلخل استقرار یافته، رشد و تكثیر می یابند. روند رشد این سلول ها در جهت بازسازی بافت در سه بعد است. یكی از اساسی ترین قسمت های مهندسی بافت، داربست های زیست تخریب پذیر هستند كه تحت نام Scaffold شناخته می شوند. این داربست ها در حقیقت بستری متخلخل با ساختاری شبیه به ماتریس برون سلولی بافت (ECM) هستند كه رشد سلول را به سمت تشكیل بافت مورد نظر جهت می دهند. از آنجا كلیه سلول های بدن به غیر از سلول های سیستم خون رسانی و بافت های جنینی خاص بر روی ECM رشد می كنند، ایجاد یك بستر مصنوعی در محیط in vitro بسیار اهمیت دارد. با رشد سلول ها بر روی داربست، داربست تخریب می شود. جنس این داربست ها پلیمر و در بعضی موارد كامپوزیت پلیمر- سرامیك است. پلیمر های متداول مورد استفاده در مهندسی بافت در جدول 1 آورده شده است.
پر استفاده ترین پلیمر ها در مهندسی بافت پلیمرهای خانواده پلی- هیدروكسی اسید شامل PGA , PLA و PLGA هستند كه به طور گسترده به عنوان داربست مورد استفاده قرار می گیرند. داربست های كامپوزیت پلیمر-سرامیك در موارد ارتوپدی استفاده شده و از مهمترین سرامیك های به كار رفته در آنها می توان به تری كلسیم فسفات، تتراكلسیم فسفات و هیدوركسی آپاتیت اشاره كرد. علت به كارگیری سرامیك ها در داربست، افزایش استحكام پلیمر، چسبندگی به استخوان و قابلیت تحرك رشد درون استخوان است. بهینه ترین كامپوزیت در این مورد تركیب PLGA و هیدروكسی آپاتیت شناخته می شود.
مكانیزم تخریب PGA , PLA و كوپلیمر های آنها بر اساس هیدرولیز تصادفی باندهای استری زنجیره پلیمری است. محصول نهایی این تخریب آب و است كه به آسانی از بدن دفع می شوند. یك داربست ایده آل باید دارای تخلخل مناسب برای انتشار مواد غذایی بوده و امكان پاكسازی مواد زائد را داشته و دارای پایداری مكانیكی مناسبی جهت تثبیت و انتقال بار باشد. علاوه بر این، شیمی سطح ماده باید چسبندگی سلول و علامت دهی داخل سلولی (intracellular signaling) را به نحوی ارتقاء دهد كه سلول ها فنوتیپ طبیعی خودشان را بروز دهند. برای رشد سریع سلول، داربست باید دارای میكروساختار بهینه باشد، فاكتورهای مهم یك داربست عبارتند از اندازه خلل و فرج، شكل و مساحت ویژه سطح. خلل و فرج موجود در داربست در حقیقت مسیرهای غذارسانی سلول ها و دفع پسماندهای سلولی هستند. برای مثال خلل و فرج بهینه برای رشد سلولهای فیبروبلاست درون رست ، خلل و فرج مناسب برای بازسازی پوست یك پستاندار بالغ 30-350 , 20-125 برای بازسازی استخوان است. بنابراین هدف اصلی در ساخت داربست، كنترل دقیق اندازه خلل و فرج و تخلخل است. مورد دیگر نحوه ایجاد چسبندگی مناسب سلول به سطح داربست است كه در این مورد هم شیوه های متفاوتی به كار برده می شود، یكی از ساده ترین شیوه ها به كارگیری رشته های كوچك پپتیدی در پروتئین های ECM است كه به عنوان واسطه مسئولیت چسبندگی سلول به بیومواد را بر عهده دارند. اجزاء گوناگون سرم قابل حل (پروتئین ها، پپتیدها) و رشته RGD برای تسهیل چسبندگی سلول شناخته شده اند.
از آنجا كه ECM بافت های مختلف باهم تفاوت دارد، داربست های مصنوعی به كار رفته برای هر بافت نیز با هم فرق می‌كند. تهیه داربست هایی با ماتریس های مختلف نیازمند به كارگیری روش های ساخت متفاوتی است كه هر یك شیوه و كاربرد منحصر به خود را دارد. از جمله این روش ها می توان به
Melt Casting , Freeze Drying , Membrane Lamination , Solvent Casting
Gas Foaming , Polymerization, Phase Separation
اشاره كرد. شكل داربست یا به عبارتی Morphology آن باید دقیقاً شبیه بافت معیوب باشد. برای شبیه سازی شكل داربست با قسمت ناقص اندام (defect) از شیوه های كامپیوتری همانند CAD استفاده می شود. داربست پردازش شده بر اساس این الگو مورفولوژی دقیقی از ناحیه معیوب بافت خواهد داشت.
در ذیل خلاصه ای از روش های مهم ساخت داربست آمده است.
قالب گیری حلال (Solvent Casting): قالب گیری حلال یك روش ساده برای تولید داربست مهندسی بافت است. در این روش پلیمر در یك حلال مناسب حل شده و در قالب ریخته می شود. سپس حلال حذف گردیده و حالت پلیمر را در شكل مورد نظر حفظ می‌كند. این شیوه به شكل های قابل حصول محدود می شود. غالباً تنها طرح های قابل شكل‌گیری در این روش صفحات صاف و لوله ها هستند. البته با قراردادن صفحات صاف روی هم نیز می توان به اشكال پیچیده تر دست یافت. در این شیوه می توان با شستن ذراتی مانند كریستال های نمك كاشته شده درون پلیمر كه Progen خوانده می شود، داربست را به صورت متخلخل درآورد. مزیت اصلی قالب گیری حلال سادگی ساخت بدون احتیاج به تجهیزات خاص است. همچنین از آنجا كه عمل ساخت در دمای اتاق انجام می گیرد نرخ تخریب پلیمر زیست تخریب پذیر به روش قالب گیری حلال كمتر از فیلم های قالب گرفته شده از طریق تراكم خواهد بود. عیب اصلی قالب گیری حلال باقی ماندن احتمالی حلال سمی درون پلیمر است. برای رفع این عیب باید به پلیمر اجازه داد تا كاملاً خشك شده و سپس با استفاده از خلاء حلال باقی مانده را خارج نمود. عیب دیگر این روش احتمال تغییر یافتن ماهیت پروتئین و دیگر مولكول های موجود در پلیمر به واسطه استفاده از حلال است. (شكل 2)
لایه سازی غشاء (Membrane Lamination): لایه سازی غشاء روش های درمانی از طریق سلول های كپسوله شده برای رهایش گسترده ای از محصولات به دست آمده از مولكول های كوچك (برای مثال، دوپامین، انكفالین ها) تا محصولاتی با ژن های بسیار بزرگ (مانند فاكتورهای رشد، ایمیونوگلوبولین ها) را در بر می گیرد. رهایش مواد فعال در مناطق خاصی از بدن به طور سنتی توسط كپسول های پلیمری تخریب پذیر و غیر تخریب پذیر كه حاوی یك یا چند دارو هستند احاطه شده است. در این حوزه مواد در حین ساخت با یك ماتریس پلیمری تركیب شده و سپس بعد از مدت زمانی مشخص از میان ماده (diffusion) و یا در خلال تخریب ماده (erusion) آزاد می شوند. در این جا كنترل مناسب كنتیك های آزاد شده از اهمیت خاصی برخوردار است. یك مثال در این مورد كنتیك های رها شده مرتبه صفر به دست آمده از میله های كوپلیمر استات اتیلن- ونیل (EVAc) به كار رفته در رهایش عامل های شیمی درمانی در مغز است. در طول دو دهه اخیر محققان تلاش كرده اند كه مواد را از ناقل های رهایش هیبریدی زیست مصنوعی (bioartificial) كه شامل لایه های غشا بر سطح اجزاء سلولی كپسوله شده كه درون غشا هستند آزاد كنند. كاربرد و هدف اصلی سلول های كپسوله شده، درمان دردهای مزمن بیماری پاركینسون و دیابت نوع I، همچنین ناتوانی های دیگر ناشی از افت ترشح عملكرد سلول است كه با كاشت اندام یا درمان های دارویی به طور كامل قابل مداوا نیستند. كپسوله كردن بافت عموما به دو شكل انجام می گیرد: لایه بندی غشا میكروكپسوله و ماكرو متخلخل در میكرو كپسوله سازی یك یا چند سلول با پراكندگی‌های كروی فراوان (با قطر 100-300 nm) كپسوله می شوند. در ماكرو كپسوله سازی تعداد زیادی از سلول ها یا توده های سلولی در یك یا چند كپسول نسبتاً بزرگ كاشته می شوند. مزیت روش دوم، پایداری شیمیایی و مكانیكی و سادگی بازیافت در صورت نیاز است. اولین دستگاهی كه به این روش تأئیدیه ایالت متحده را كسب كرده است دستگاهی به نام كبدیار (Liver assist)
انجماد- خشك سازی (Freeze- Drying): این شیوه برای تولید داربست های PLG بسیار متخلخل با مزیت قابلیت تلفیق رشد پایه پروتئینی و فاكتورهای تفاضلی در زمان پردازش، معرفی شده است. این شیوه قادر به ایجاد داربست هایی با تخلخل بیشتر از 90% و كنترل خلاء و فرج هایی به اندازه 20- 200 است. این روش پردازش شامل ایجاد یك امولسیون از طریق هموژنیزه كردن محلول پلیمر- حلال و آب، سرد كردن سریع امولسیون جهت حفظ ساختار حالت مایع و حذف حلال و آب در اثر انجماد و خشك سازی است. (شكل 3)
در این فرایند، در ابتدا دو محلول مخلوط شدنی فاز آب و یك فاز آلی را تشكیل می دهند. فاز آلی توسط حل شدن PLG با ویسكوزیته ذاتی ویژه در MC ایجاد می شود. فاكتورهای زیست فعال و عوامل فعال را می توان در این فاز حل كرد. فاز آب از آب فوق خالص به همراه آب یا بدون افزودنی های حل شدنی مختلف مانند فاكتورهای زیست فعال هیدروفیل تشكیل شده است. سپس فاز آلی و آب در یك لوله آزمایش شیشه ای كه 40% حجم آن آب است به هم اضافه شده و دو لایه نامخلوط را شكل می‌دهند. این لایه های نامخلوط به وسیله یك همگن ساز دستی كه در سرعت های مختلف نتظیم می شود همگن شده و در یك قالب مناسب (برای مثال، شیشه یا مس) ریخته می شود سپس با گذاشتن سریع قالب بر روی بلوك مس در كنار نیتروژن مایع با دمای (~ -1960C) سرد می شود. نمونه های فوق در یك دستگاه انجماد- خشك سازی سفارشی 20 motorr و دمای آغازین –1100C منجمد و خشك می شوند. بعد از اینكه دمای داخل امولسیون برای یك ساعت در –1100C به تعادل رسید، دستگاه تراكم ساز خاموش شده و دستگاه متراكم ساز و امولسیون به آرامی در طی 12h تا دمای اطاق گرم می شوند. نمونه های به دست آمده در یك دستگاه خشك ساز خلا در دمای اتاق برای ذخیره سازی و حذف بیشتر هر گونه حلال باقیمانده قرارداده می شوند.
جداسازی فاز (Phase Separation): این روش بر اساس جداسازی فاز مایع- جامد در محلول پلیمر در اثر بلورینگی حلال عمل می‌كند. اسفنج به دست آمده در اثر فرآیند جداسازی فاز مایع- جامد دارای مورفولوژی لوله ای شكل ناهمگون با یك ساختار نردبانی شكل داخلی است. اسفنج فوق با شبكه ای از خلل و فرج های پیوسته توسط القای گرمایی جداسازی فاز مایع- مایع ایجاد می شود. ماتریس رشته ای مصنوعی با فیبرهایی با قطری به مقیاس نانومتر توسط فرآیند ژل سازی به وسیله القای گرمایی تهیه می شوند. ماتریس های نانو رشته ای با ساختار ماكرومتخلخل به وسیله تركیب روش پالایش پروژن و فرآیند ژل سازی به وسیله القای گرمایی به دست می آیند. اسفنج های متخلخل پلیمرهای زیست تخریب پذیر و آپاتیت های استخوانی معدنی شكل توسط فرآیند جداسازی فاز مایع- جامد و فرآیند زیست تقلیدی تهیه می شوند. جداسازی فاز محلول پلیمر را می توان به چندین روش ایجاد كرد، كه شامل جداسازی از طریق غیر حلال، جداسازی فاز از طریق شیمیایی و جداسازی فاز از طریق گرمایی (TIPS) می شود. در فرایندTIPS كه یك روش نسبتاً جدید برای تهیه غشاهای متخلخل است، دمای محلول پلیمر كاهش یافته و جداسازی فاز رخ می دهد كه فاز اول آن غنی از پلیمر و فاز دوم فقیر از پلیمر است. بعد از خارج سازی حلال از طریق عصاره گیری، تبخیر یا تصعید، پلیمر موجود در فاز غنی از پلیمر به شكل اسكلت سخت شده و فضاهای اشغال شده توسط حلال در فاز عاری از پلیمر به صورت خلل و فرج اسفنج پلیمر در می آیند. غشاهای به دست آمده از این فرایند معمولاً دارای خلل و فرجی با قطر چندین میكرومتر بوده و معمولاً برای داربست های مهندسی بافت مناسب نیستند. (شكل 4)
بسپارش (Ploymerization): داربست های به دست آمده از طریق روش بسپارش كاندیدهای خوبی برای مهندسی بافت به شمار رفته و به دلیل سهولت ساخت نسبت به روش های دیگر ساخت داربست ارجحیت دارند. با وجودیكه پلیمرهای متخلخلی را می توان به این روش بسپارش كرد اما تعداد كمی از آنها منجر به داربست های متخلخل می شوند. در این روش تركیب منومر در حضور حلالی كه منومر در آن قابل حل ولی پلیمر غیر قابل حل است، درون قالب بسپارش می شود. گذار حلالیت در خلال بسپارش منجر به دو فاز می گردد، ساختار زیستی پیوسته پلیمر و حلال. بدین ترتیب داربست تولیده شده در نتیجه بسپارش برای ایجاد خلل و فرج های درهم نیازی به پالایش پروژن ندارند. اسفنج ها یا داربست های PHEMA ساخته شده به این روش دارای قابلیت دخول سلول بوده و حلال مازاد آنها معمولاً آب است. اسفنج های PHEMA به منظور افزایش حجم پستان و جایگزینی غضروف بینی نگهدارنده بین بافت قرنیه و هسته مركزی و جایگزین بافت های نرم به كار برده می شوند. یكی از معایب این اسفنج‌ها، آهكی شدن آنها پس از مرور زمان است. این اسفنج ها قابلیت تحمل اتوكلاو را داشته و به سادگی به اشكال مختلف تغییر فرم می دهند.
اسفنج سازی گازی (Gas Foaming): روش اسفنج سازی گازی به دلیل قابلیت تخلخل پذیری بالا بدون به كارگیری دمای بالا یا حلال آلی حائز اهمیت است. با حذف دمای بالا و حلال آلی می توان مولكول های زیست فعال بزرگ شامل فاكتورهای رشد را با حفظ فعالیت زیستی در پلیمر مجتمع ساخت. پلیمری كه در این روش پردازش می شود PLGA است. در این روش گرانول های PLGA و پروژن كه معمولاً كلرید سدیم است در یك كانتینر با فشار بالا (در حدود 5.5 Mpa) با CO2به مدت 24h به تعادل می رسند. در این مدت گاز CO2 در پلیمر كه اكنون در تعادل ترمودینامیكی به حالت سیال در آمده است حل می شود. سپس فشار را به سرعت كاهش می دهند. افت سریع فشار سبب به هم خوردن تعادل ترمودینامیكی و در نتیجه تشكیل هسته حباب های CO2 در پلیمر می گردد. پلیمر كه پس ازكاهش فشار تمایل به رسیدن به حالت جامد دارد به شكل اسفنج منبسط میشود. ذرات پلیمری منفرد در اطراف ذرات پروژن منبسط شده و پس از پالایش پروژن فوق یك داربست بسیار متخلخل با خلل و فرج های باز كنترل شده به دست می آید. از جمله مزایای این روش كنترل اندازه خلل و فرج و قابلیت ایجاد داربست های بزرگ، عدم استفاده از حلال آلی و دمای بالا را می توان نام برد. (شكل 5)
شكل 6، طرح بسیار ساده ای از فرآیند مهندسی بافت را نمایش می دهد. در ابتدایی ترین مرحله این نمودار، بافت از طریق biopsy خارج می گردد. بافت فوق میتواند Autograft (بافت خود فرد) یا Allograft (بافت فرد دیگر) یا Xenograft (بافت گونه دیگر) باشد. بافت به دست آمده در این مرحله همانند بانك خون وارد قرنطینه شده و از جنبههای مختلف بیماری زایی مانند وجود ویروس HIV یا هپاتیت C,B، و تغییرات بردارهای ژنی مورد بررسی قرار می گیرند. بافت ها تا زمان تعیین ایمنی نهایی در قرنطینه و شرایط سرد نگهداری می شوند.
مرحله بعد شامل تست های ایمنی است كه شامل آزمون بافت از نظر Sterility در محیط تیوگلیكولات یا مواد تصویب شده دیگر،تعیین سمیت توسط آزمایش LAL و تست میكوپلاسما توسط كشت مستقیم در محیط Sentry Cell Culture میشود.
پس از مراحل فوق پردازش بافت كه شامل دو قسمت گزینش و جداسازی سلول از بافت است شروع می گردد. در مرحله جداسازی، سلولها از طرق مختلف از بافت جدا میشوند. این طرق شامل روش‌های برون كاشت، آنزیمی، مكانیكی، تجزیه شیمیایی، تزریقی و تركیبی میشود. گزینش سلولی بر اساس خاصیت منحصر به فردی كه یك سلول را از دیگری متمایز می كند مانند چگالی، اندازه، نشانه گذاری، گذرگاههای منحصر به فرد متابولیكی و احتیاجات غذایی صورت می گیرد.
سلولهای بدست آمده بر روی داربست كاشته شده و در محیط كشت سلولی كه شامل مخلوطی از مواد غذایی ضروری (نمكها، آمینو اسیدها، ویتامینها، كربوهیدراتها، اسیدهای چرب)، بافرها (تثبیت كنندهها) و عناصر ردیابی بصورت مكمل فاكتورهای میتوژنیك مشتق شده از حیوان، هورمونهای مصنوعی و فاكتورهای رشد می باشد قرار می گیرد. انواع خاصی از سلولهای برای تكثیر نیازمند هم كشتی با سلولهای feeder هستند.
سلولها برای مدتی معین بر روی داربست كشت یافته و سپس در محل آناتومیكی مورد نظر Transplant می شوند.
قیمت فایل فقط 8,900 تومان
برچسب ها : ساخت داربست های مهندسی بافت به روش Gas Foaming , طرح توجیهی ساخت داربست های مهندسی بافت به روش Gas Foaming , دانلود ساخت داربست های مهندسی بافت به روش Gas Foaming , داربست مهندسی بافت , برق , قالب گیری حلال , , داربست های مهندسی بافت , دانلود طرح توجیهی , پروژه دانشجویی , دانلود پژوهش , دانلود تحقیق , پایان نامه , دانلود پروژه